小鼠熱休克蛋白70(HSP-70)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)

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ELISA 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)   　　 1. 　正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或 BSA 等封閉。   　　 2. 　在 ELISA 中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括 :   　　 (1) 　固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是 40 孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。   　　（ 2)  包被抗體 ( 或抗原 ) 的選擇：將抗體 ( 或抗原 ) 吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好 , 吸附時(shí)一般要求 PH 在 9.0 ～ 9.6 之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響 , 一般多采用 4 ℃ 18 ～ 24 小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度 (0.1 、 1.0 和 10 μ g ／ ml 等 ) 進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽(yáng)性標(biāo)本的 OD 值。選擇 OD 值 zui大而蛋白量最少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為 1 ～ 10 μ g ／ ml 。   　　 (3) 　酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接 ELISA 法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定 ( 見(jiàn)酶標(biāo)記抗體部份 ) 。然后再固定其它條件或采取 “ 方陣法 ” ( 包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度 ) 在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。   　　 (4) 　酶的底物及供氫體的選擇：對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無(wú)色。有些供氫體 ( 如 OPD 等 ) 有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如 TMB 和 ABTS 是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以 10-30 分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是 H2O2 在臨用前加入。